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HPLC中流動相的配置的小妙招

更新時間:2016-09-10      點擊次數:4930

樣品配置的小妙招:

 1.選用流動相配置對色譜峰影響zui小

 2.流動相溶解度達不到要求時,盡量選用流動相中含有的比例較大的成分(有待考證),以減輕進樣對流動相的影響造成基線不穩。

 3.流動相組成溶劑均達不到要求時,選取的溶劑應保證在設定波長內無紫外吸收。

  流動相的PH

      如需在一定PH值下操作,須定期測定流動相的PH值,大氣中的CO2溶解在流動相內將引起PH值的改變,特別是貯液瓶密閉不嚴時這種影響可能更大。

 更換柱子及流動相

       軟質或半軟質填料的溶脹率隨溶劑極性的變化而變化,使用新柱時應先用25~30倍柱容積的合適流動相平衡;更換流動相時,如果兩種流動相不互溶,需采用過渡溶劑使前一種流動相逐步溶解除去,(例如,2、2、4-*基戊烷換成甲醇時,必須用乙酸已酯或其他溶劑過渡,直到標準物保留值達到穩定狀態)。

 

HPLC中流動相的配置必須注意以下幾點:

 流動相的選擇

 流動相的混合

    雙泵主要是在探討流動相的配比或者梯度洗脫是比較方便,知道確切的液相條件時,建議配好后使用的話,混合比較均勻,效果較好。

脫氣

 HPLC所用流動相必須預先脫氣,否則容易在系統內逸出氣泡,影響泵的工作。

 系統中氣泡的產生:流動相本身存在,梯度淋洗混合后放出氣泡;

 氣泡的影響:存在于管路中,系統壓力不穩定,實驗結果有偏差;

 存在于單向閥中,易造成液體回流,流量不準確,甚至是不吸液;

 存在于檢測器中,出現鬼峰,影響檢測準確性。

        所以做液相對流動相的氣泡和雜質要求比較嚴格。氣泡會影響柱的分離效率,檢測器的靈敏度、基線穩定性,甚至使無法檢測。(噪聲增大,基線不穩,突然跳動)。此外,溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相(如烷基胺)反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化,對分離或分析結果帶來誤差。  

      溶解氧能與某些溶劑(如,甲醇、四氫呋喃)形成有紫外吸收的絡合物,此絡合物會提高背景吸收(特別是在260nm以下),并導致檢測靈敏度的輕微降低,但更重要的是,會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰(假峰)。在熒光檢測中,溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象,特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下,熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中(特別是還原電化學法),氧的影響更大。除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能,也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。

       常用的脫氣方法有:加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑,若采用抽氣或煮沸法,則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。

 1.氦氣脫氣:氦氣脫氣是很有效的脫氣方法。氦氣緩緩的通過流動相趕去溶入的空氣,如果使用得當,在10min內可除去80%~90%的溶入氣體。由于氦氣在流動相中的溶解度極低,所以用氦氣脫氣保護的流動相可以認為是一個無氣體溶解體系。其缺點是氦氣價格比較昂貴,會增加檢驗成本。一般說來有機溶劑中的氣體易脫除,而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法,這種連續脫氣法在電化學檢測時經常使用。但氦氣昂貴,難于普及。

 2.真空脫氣:也是比較常用的脫氣方法。現在多數企業都zui常用這種辦法,貯液器被抽成部分真空,溶入的氣體蒸發形成氣泡溢出,其效果僅次于氦氣脫氣。象Agileng1200液相色譜使用的是在線脫氣機。在線脫氣只適合脫完氣之后的流動相,在使用過程中的微量脫氣。

 3.超聲波脫氣:將配制好的流動相連容器放入超聲水槽中脫氣10~20min。這種方法比較簡便,又基本上能滿足日常分析操作的要求,所以,目前仍廣泛采用。這種方法只能除去30%的溶解氣體,有時還會引起氣體溶解度的增加。對氧敏感的檢測器不宜用此法。

 4.加熱回流脫氣:該方法雖然效果很好,但是適用范圍較窄。對于有機溶劑或混合流動相不適合用此法,因為揮發性組分會損失掉,改變流動相的組成。

      綜合來說,用真空抽濾后,再用超聲脫氣還是zui常用的辦法,用氦氣的方法是效果的辦法,而在線脫氣本身也是真空脫氣,但它可以放到儀器上使用,是一種保證性的辦法。

 A.離線(系統外)脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態,在你停止脫氣后,氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內,溶劑又將被環境氣體所飽和。

 B.在線(系統內)脫氣法無此缺點。zui常用的在線脫氣法為鼓泡,即在色譜操作前和進行時,將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說,此方法不能將溶劑脫氣,它只是用一種低溶解度的惰性氣體(通常是氦)將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。 

 

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